澳大中医药科研所： 豨莶草乙醇提取物阻断HMGB1诱导的RAGE与CD11b互作减轻中风后中性粒细胞介导的神经损伤

　　豨莶草乙醇提取物通过阻断HMGB1诱导的RAGE与CD11b的相互作用，减轻中风后中性粒细胞介导的神经损伤

　　背景：缺血性中风是一种危及到生命的脑血管疾病，治疗选择有限。在急性缺血性中风（AIS）的进展过程中，由高迁移率族蛋白1（HMGB1）介导的中性粒细胞参与的炎症显著加剧了神经损伤。豨莶草（Siegesbeckia orientalis L.，SO）是豨莶草药材的大多数来自之一，在抗神经炎症和调节中性粒细胞功能方面具有潜力。因此，推测SO可能对AIS后的神经炎症损伤具有保护作用。

　　目的：本研究旨在探讨豨莶草乙醇提取物（EESO）对AIS后神经炎症损伤的改善作用，并重点研究其相关机制，特别是HMGB1驱动的中性粒细胞募集和中性粒细胞外陷阱（NETs）的生成。

　　方法：建立小鼠光栓塞中风模型，以评估EESO给药对AIS的改善效果。通过组织病理学检查和免疫荧光染色观察脑神经损伤、中性粒细胞浸润和NETs的生成。此外，还通过qPCR和ELISA分别检测炎症指标和血清HMGB1水平。体外实验中，评估了含EESO血清对中性粒细胞迁移和NETs生成的影响。通过HMGB1过表达模拟转染、细胞热位移分析和共免疫沉淀实验，研究含EESO血清中的化合物是否靶向HMGB1以阻断晚期糖基化终产物受体（RAGE）与CD11b的相互作用。此外，还筛选并验证了EESO中靶向HMGB1的潜在活性成分。

　　结果：EESO给药显著减轻了光化学诱导的小鼠AIS，表现为明显减少梗死体积，改善脑血流和神经功能。此外，EESO给药显著减轻了继发性神经损伤，抑制了中性粒细胞浸润和NETs生成，并降低了血清促炎介质和HMGB1的水平。体外实验中，含EESO血清中的化合物直接与神经源性HMGB1相互作用。通过RAGE-CD11b相互作用，HMGB1驱动的中性粒细胞迁移和NETs生成被含EESO血清给药逆转。此外，异欧前胡素（isoimperatorin）、4,7-二甲基四氢萘-1-酮、荆芥内酯（perillartine）和达芦根醇（darutigenol）作为活性成分，对HMGB1驱动的中性粒细胞迁移和NETs生成具有抑制作用。

　　结论：本研究首次证实HMGB1通过促进CD11b与RAGE之间的相互作用来驱动NETs生成。此外，EESO被证实靶向神经源性HMGB1，抑制中性粒细胞浸润和NETs生成，从而减轻中风后的神经炎症损伤。这一作用归因于被吸收进入血液的成分，包括异欧前胡素、4,7-二甲基四氢萘-1-酮、荆芥内酯和达芦根醇。

　　中风通常分为缺血性中风（IS）和出血性中风（HS），仍然是全球医疗保健的负担，具有高致残率和死亡率。有必要注意一下的是，70%~80%的中风患者被诊断为IS，这是由于短暂性或永久性脑动脉闭塞所致。包括高血压、房颤、糖尿病、吸烟和久坐生活方式在内的众多危险因素会引发IS。迄今为止，尽管出现了先进的技术，但机械取栓和组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）的静脉溶栓仍然是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的急性缺血性中风（AIS）的常规治疗选择。机械取栓的实施需要高水平的医疗设施和熟练的操作者，而静脉t-PA溶栓则对时间要求严格（在AIS发病后4.5小时内），并且有可能会出现再通率低和出血转化，严重限制了受益人群。

　　除了提高再通率外，保护神经元免受中风后继发性损伤也至关重要。在AIS的病理生理演变中，中断的血液供应会导致神经元损伤和潜在坏死，随后发生神经元能量衰竭。除了梗死核心中不可逆的神经元坏死外，梗死周围区域（半暗带）的神经元也会因炎症级联反应而经历可逆性损伤。在炎症细胞中，中性粒细胞被认为是被招募到缺血半球的“第一反应者”，并在脑缺血后约2~3天达到峰值。此外，许多研究强调了中性粒细胞在放大神经元损伤中的关键作用。浸润的中性粒细胞不仅释放大量促炎介质，包括蛋白酶、细胞因子和趋化因子，还会在特定刺激下生成中性粒细胞外陷阱（NETs）。NETs是由去浓缩染色质和颗粒蛋白装饰的纤维网络，为促凝分子的粘附提供了支架，并促进了凝血级联反应。NETs的促凝潜力对血管再通构成了威胁。此外，NETs的成分（如组蛋白）会对邻近神经元造成直接损伤。因此，抑制中性粒细胞浸润和NETs生成是一种有前景的AIS治疗策略。

　　最近有报道称，AIS患者的循环高迁移率族蛋白1（HMGB1）水平非常明显升高，并与功能预后不良紧密关联。细胞外HMGB1已被证明可以诱导NETs释放，并将中性粒细胞招募到缺血半球，从而促进神经炎症损伤。有趣的是，HMGB1驱动的中性粒细胞招募被证明依赖于巨噬细胞-1抗原（Mac-1，CD11b/CD18）与晚期糖基化终产物受体（RAGE）之间的相互作用，而Mac-1-RAGE相互作用会导致中性粒细胞中核因子-κB（NF-κB）的激活。然而，HMGB1触发的Mac-1与RAGE之间的相互作用在促进NETs生成中的作用尚待阐明。

　　豨莶草（Sigesbeckiae Herba），也被称为“豨莶草”，是一种传统的中药，用来医治中风已有数百年历史，如《本草纲目》中所记载。作为豨莶草药材的来源之一，豨莶草（Siegesbeckia orientalis L.，SO）富含倍半萜类和二萜类化合物，并拥有非常良好的药理活性，尤其是抗炎和神经保护作用。研究表明，SO的50%乙醇提取物对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7细胞中的炎症介质具有抑制作用。使用D101大孔树脂制备的SO提取物给药表现出显著的抗神经炎症作用，并通过调节小胶质细胞功能和炎症细胞因子，缓解了手术诱导的认知功能障碍。此外，从SO中分离的香豆素类倍半萜内酯在LPS刺激的人类中性粒细胞中抑制了白细胞介素（IL）-1β和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的产生，并下调了粘附分子CD11a、CD11b和CD62L的表达。

　　鉴于SO的抗神经炎症和调节中性粒细胞的特性，本研究评估了SO乙醇提取物（EESO）对光化学诱导的小鼠AIS的影响，并确定了其通过阻断RAGE-CD11b相互作用来抑制HMGB1驱动的中性粒细胞浸润和NETs生成的机制。此外，还筛选并验证了EESO中靶向HMGB1的潜在活性成分。

　　通过检测脑血流、梗死体积和神经功能来评估EESO对小鼠AIS的改善效果。如图2B-G所示，光化学损伤导致小鼠右侧大脑半球出现非常明显的血流减少和缺血性梗死。然而，与模型组相比，EESO给药（75和150 mg/kg）以及通过注射Ly6G抗体耗竭中性粒细胞（阳性对照）显著恢复了脑血流灌注，并减少了梗死体积。

　　此外，与假手术组相比，模型组小鼠在中风后24小时表现出明显的神经功能障碍，评分更高，并持续了3天（图2H）。其中，中风小鼠的对侧前肢的站立、站立姿势和步态周期明显地增加，而摆动速度则显著下降（图2J-M）。相反，EESO给药和中性粒细胞耗竭逆转了神经功能评分和步态参数的变化，且150 mg/kg的EESO给药在后期对步态参数的改善尤为显著。

　　通过苏木精-伊红（H&E）染色和尼氏染色（Nissl’s staining）清晰地展示了神经损伤的范围和程度（图3A和C）。脑缺血后，模型组观察到从大脑皮层延伸至海马区的受损区域。同时，模型组的尼氏小体形状不规则、分布散在且数量显著少于假手术组，表明中风小鼠存在很明显的神经损伤。然而，EESO给药和中性粒细胞耗竭显著缩小了受损区域，并减轻了脑缺血后尼氏小体的丢失。此外，与假手术组相比，中风后缺血半暗带中存在持续性神经损伤，表现为凋亡神经元（caspase 3阳性神经元）的存在（图3B和D）。相反，EESO给药和中性粒细胞耗竭显著减少了凋亡神经元的数量。

　　如上所述，中性粒细胞耗竭显著改善了中风后的神经功能缺损，这可能归因于中性粒细胞浸润和中性粒细胞外陷阱（NETs）生成的减少。因此，进一步研究了EESO给药对中性粒细胞浸润和NETs生成的影响。脑缺血导致梗死核心和缺血半暗带中性粒细胞数量明显地增加（图3E和G），这些细胞分布在血管和脑实质中。此外，部分迁移的中性粒细胞生成了NETs，这通过髓过氧化物酶（MPO）、瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3，NETs标记物）和DAPI（双链DNA）的共定位得以证实，同时半暗带中MPO、PAD4和CitH3的表达水平升高（图3F和H）。相比之下，150 mg/kg的EESO给药和抗Ly6G抗体处理显著减轻了中风后的脑中性粒细胞浸润和NETs生成。

　　中性粒细胞浸润和NETs生成通过启动和放大脑部炎症反应，加剧了神经损伤。因此，我们检测了相关的炎症指标。如预期所示，与假手术组相比，模型组小鼠在缺血半暗带中TNF-α和IL-1β的mRNA表达明显地增加（图4A-B）。此外，与中性粒细胞浸润相关的分子MCP-1和CXC趋化因子受体2（CXCR2）的mRNA水平在光化学损伤后也非常明显升高（图4C-D）。然而，150 mg/kg的EESO给药和中性粒细胞耗竭显著下调了中风后TNF-α、IL-1β、MCP-1和CXCR2的mRNA表达。有必要注意一下的是，EESO给药还显著逆转了中风小鼠血清中HMGB1水平的升高（图4E）。免疫荧光染色结果也表明，受损神经元是中风后血清HMGB1的大多数来自之一，表现为缺血核心中缺乏HMGB1阳性的神经元，以及半暗带神经元中HMGB1向细胞质甚至细胞外的转位（图4F）。EESO给药在某些特定的程度上减轻了HMGB1从神经元的转位和释放。因此，根据结果得出，EESO给药缓解了神经元来源的HMGB1释放和炎症指标的表达。

　　为了研究EESO给药是否通过HMGB1途径缓解中性粒细胞募集和NETs生成，我们建立了过表达HMGB1的N2a细胞系，并与中性粒细胞共培养。对于接受错配模拟转染的N2a细胞，氧糖剥夺（OGD）促进了神经元HMGB1的释放，随后导致中性粒细胞向下游室迁移和NETs生成。此外，OGD诱导的HMGB1释放、中性粒细胞迁移和NETs生成被10%的含EESO血清处理显著抑制。有趣的是，与错配模拟转染相比，OGD损伤后过表达HMGB1的N2a细胞中，这些变化进一步加剧，表明神经元HMGB1直接促进了中性粒细胞迁移和NETs生成。同时，由于对过表达HMGB1的N2a细胞中过量HMGB1的微弱影响，含EESO血清的处理未能逆转中性粒细胞迁移和NETs生成（图5B-E）。如细胞热位移分析（CETSA）结果显示（图5F），与空白血清组相比，含EESO血清的处理明显地增强了N2a细胞中HMGB1的耐热性（52-64°C），表明含EESO血清中存在的某些化合物能够直接与神经元来源的HMGB1相互作用。上述根据结果得出，EESO中的活性成分靶向HMGB1以抑制中性粒细胞迁移和NETs生成。

　　6、EESO通过阻断RAGE与CD11b的相互作用抑制HMGB1驱动的中性粒细胞迁移和NETs生成

　　通过流式细胞术发现，在HMGB1作用后，中性粒细胞表面CD11b（Mac-1的α亚单位）的平均荧光强度（MFI）减弱（图5G），这可能与HMGB1驱动的中性粒细胞募集和激活过程中RAGE与CD11b之间的功能相互作用有关。如预期所示，HMGB1作用后，与RAGE共沉淀的CD11b蛋白水平明显地增加（图5H），表明CD11b与RAGE之间的相互作用增强。相反，EESO血清处理显著减少了HMGB1促进的CD11b与RAGE的共沉淀。进一步研究表明，含EESO血清、Azeliragon和抗CD11b抗体的处理显著抑制了HMGB1驱动的中性粒细胞迁移（图6B）。此外，含EESO血清的处理还通过降低MPO、PAD4和CitH3的蛋白表达来抑制NETs生成，其效果与Azeliragon和抗CD11b抗体处理相似（图6C-G）。这表明，通过阻断RAGE与CD11b之间的相互作用，可以有效抑制HMGB1驱动的NETs生成。

　　基于前面部分的研究结果，随后对EESO血清中靶向HMGB1的潜在活性成分进行了筛选。通过超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）分析，鉴定出与空白组相比具有非常明显差异的12种成分，包括4,7-二甲基四氢萘-1-酮、 rutaecarpine（芸香碱）、perillartine（荆芥内酯）、isoimperatorin（异欧前胡素）、semilicoisoflavone B、phytolaccagenin（商陆素）、花生四烯酸（无过氧化物）、血根碱、(2S)-2-甲氧基库拉酮、虾青素、formononetin 7-O-葡萄糖醛酸苷和(-)-丁香树脂酚，这些是EESO在血液循环中被吸收的主要成分（图7A-B）。此外，EESO的特征成分darutigenol（达芦根醇）和darutoside（达芦苷）也在含EESO血清中被发现。在这些候选化合物中，4,7-二甲基四氢萘-1-酮、芸香碱、荆芥内酯、异欧前胡素和达芦根醇被预测为EESO中靶向HMGB1的潜在活性化合物，其结合能分别为6.25、5.4、4.98、4.87和4.41 kcal/mol（表2）。它们均与HMGB1的B-box结构域形成了氢键。配体-靶标复合物的三维和二维对接构象如图7C所示。

　　8、EESO的潜在活性成分减轻了HMGB1驱动的中性粒细胞迁移和NETs生成

　　相应地，除了芸香碱外，EESO的潜在活性成分（包括4,7-二甲基四氢萘-1-酮、荆芥内酯、异欧前胡素和达芦根醇）的处理显著减少了HMGB1驱动的中性粒细胞迁移数量和发生NETs生成的中性粒细胞百分比（图8A-C）。有必要注意一下的是，异欧前胡素在这些化合物中对中性粒细胞迁移和NETs生成的压制效果最显著。此外，异欧前胡素处理显著阻断了HMGB1驱动的RAGE与CD11b之间的相互作用，这通过共沉淀的CD11b水平降低得以证实（图8D）。异欧前胡素对NETs生成的抑制作用还通过MPO和CitH3蛋白表达水平的下调结果进一步支持（图8E）。因此，被吸收的活性成分，尤其是异欧前胡素，对EESO靶向HMGB1发挥了及其重要的作用，通过阻断RAGE-CD11b相互作用，减轻了中性粒细胞募集和NETs生成。

　　本研究聚焦缺血性中风（AIS）。鉴于神经功能恢复对预后的重要性，炎症引发的继发性神经损伤非常关注。多数临床前神经保护剂临床效果不佳，而中药有临床治疗中风优势，豨莶草（SO）用于中风治疗历史悠远长久。本研究探讨了豨莶草乙醇提取物（EESO）对急性缺血性中风（AIS）的保护作用及其机制。

　　研究通过小鼠光化学诱导血栓栓塞性中风模型发现，EESO通过抑制中性粒细胞浸润和NETs生成，显著改善了小鼠AIS模型的神经功能缺损和脑组织损伤。其作用机制与靶向HMGB1、阻断RAGE-CD11b相互作用紧密关联。此外，通过UPLC-MS和分子对接技术，筛选出异欧前胡素、4,7-二甲基四氢萘-1-酮等活性成分，这些成分协同作用，抑制HMGB1驱动的中性粒细胞迁移和NETs生成。本研究不仅证实了豨莶草在中风治疗中的传统应用价值，还揭示了其潜在的药理机制，为开发新型神经保护剂提供了科学依据。

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